新型光散射抑制機制助力高保真光固化生物3D打印

更新時間：2023-06-01

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光固化生物3D打印技術(shù)（如：數(shù)字光處理，DLP）可精確控制細胞和生物材料在空間中的分布，以此構(gòu)建復(fù)雜幾何結(jié)構(gòu)，被廣泛應(yīng)用于組織工程、藥物篩選、外科植入物等生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。然而，在DLP打印過程中，光在固液兩相界面會產(chǎn)生物理散射，細胞的混入會加劇此種散射效應(yīng)，導(dǎo)致水凝膠在非目標區(qū)域固化，降低了打印精度，使眾多生物性能優(yōu)異且具有小尺度特征（如血管網(wǎng)絡(luò)和薄壁結(jié)構(gòu)等）的復(fù)雜結(jié)構(gòu)難以成型，限制了DLP打印技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。針對這一挑戰(zhàn)，湖南大學(xué)機械與運載工程學(xué)院韓曉筱教授等提出了一種光吸收與自由基反應(yīng)協(xié)同作用的光散射抑制新機制，并基于此機制開發(fā)了一種新型光抑制劑（Curcumin-Na，Cur-Na），降低了載細胞水凝膠光固化打印過程中的光散射效應(yīng)，將打印精度提高到1.2-2.1像素點，幾何誤差低于5%，成功制造了各種具有多尺度通道和薄壁網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的生物活性功能支架。此外，該方法具有較寬的打印參數(shù)窗口，極大地縮短了參數(shù)優(yōu)化過程。相關(guān)研究成果以題為"Photoinhibition via simultaneously photoabsorption and free-radical reaction for high-fidelity light-based bioprinting"的文章發(fā)表在《Nature Communications》（SCI一區(qū)，Top期刊，IF=17.69）。湖南大學(xué)博士研究生賀寧為第一作者，湖南大學(xué)機械與運載工程學(xué)院韓曉筱教授和陳鋒副教授為通訊作者。

水凝膠生物墨水中傳統(tǒng)的光吸收劑能夠吸收過量的光能量，防止打印層厚過厚，從而在一定程度上提高垂直方向上的打印精度。然而，傳統(tǒng)的光吸收劑難以解決由光散射引起的水平方向上過固化的問題。因此，該研究提出了光吸收與自由基反應(yīng)協(xié)同作用的光抑制機制：保留傳統(tǒng)光吸收劑功能的同時并能“搶奪"水平方向上散射光激發(fā)的自由基，抑制散射區(qū)域的自由基與水凝膠發(fā)生聚合反應(yīng)，防止非目標區(qū)域的固化，從而提高水平方向上的打印精度和保真度?；诖藱C制，該團隊首先成功開發(fā)了一種新型光抑制劑（Cur-Na）（如圖1），其具有良好水溶性和生物相容性。接著，該團隊制備了含不同光抑制劑的PEG-GelMA生物墨水，通過研究生物墨水的物化性質(zhì)評價了其可打印性和機械性能（如圖2）。然后通過理論和實驗研究聚合過程，揭示了Cur-Na減輕散射效應(yīng)的機制（如圖3）：Cur-Na的吸收峰位于425nm附近，非常接近光源波長，可以作為典型的光吸收劑降低光穿透深度。同時，Cur-Na 可以通過更高的反應(yīng)速率競爭性地搶奪自由基來阻止水凝膠單體聚合形成固化水凝膠。再者，Cur-Na 的反應(yīng)產(chǎn)物為液體，避免了非目標區(qū)域的固化。由于 Cur-Na 的高反應(yīng)性速率，固定濃度的 Cur-Na 可以在很寬的光強度范圍內(nèi)抑制散射效應(yīng)，避免在打印不同結(jié)構(gòu)的時，打印參數(shù)再次優(yōu)化，提高打印效率。文章中，圖4和圖5定量研究了加入Cur-Na后的生物墨水的打印分辨率和圖案保真度，以驗證Cur-Na在解決光散射效應(yīng)方面的有效性。之后，團隊將添加了Cur-Na的生物墨水應(yīng)用到摩方精密 microArch S140光固化打印機中，成功地制造了各種復(fù)雜結(jié)構(gòu)體（仿生支架，可灌注血管網(wǎng)絡(luò)，極小三周期曲面等），證明了該光抑制劑在制造具有小尺度特征的功能性載細胞三維支架方面的卓。越能力（如圖6）。圖7進一步證明了此生物墨水在組織工程中的適用性。

圖1. 姜黃鈉的合成。a. 用姜黃素和碳酸氫鈉合成姜黃素鈉（Cur-Na）的過程。姜黃素分子中酚羥基的H⁺被Na⁺取代（紅色橢圓），而姜黃素中的羰基鍵發(fā)生酮-烯醇互變異構(gòu)（藍色橢圓）。b. 姜黃素和Cur-Na的¹H-NMR光譜，顯示了合成過程中發(fā)生的化學(xué)性質(zhì)的代表性變化。藍色陰影區(qū)域表示酚羥基的特征共振（δ=9.65ppm）。綠色陰影是烯烴信號（δ=5.93ppm），表明C=C雙鍵的形成。

圖2. 生物墨水的物化性質(zhì)。添加了不同濃度光抑制劑的生物墨水（PEG-GelMA/LAP）的儲能模量（G'反映材料的剛度）和損失模量（G''反映材料粘度）隨時間的變化：a.檸檬黃和b. Cur-Na。G'和G'之間的交叉點被稱為凝膠點，而凝膠時間被定義為曝光開始至凝膠點的時間（在該研究中約為20秒）。生物墨水在405nm、13mW cm^?2的光照下曝光30s。陰影區(qū)域表示曝光時間。c. 水凝膠的應(yīng)力-應(yīng)變曲線。d. 三種水凝膠在~20%應(yīng)變下的彈性模量。三種生物墨水的e. 溶脹比和f. 溶膠分數(shù)對比。

圖3. Cur-Na抑制散射效應(yīng)的機制。a. 示意圖顯示了當光穿透生物墨水時光強的高斯分布以及不同情況下產(chǎn)生的固化區(qū)域，包括無散射、有散射、與細胞混合的生物墨水和添加Cur-Na的生物墨水。C_d和C_w分別是固化深度和固化寬度。E₀表示生物墨水表面的光強度，而E_C是引發(fā)聚合所需的臨界能量。b. Cur-Na自由基鏈生長聚合的動力學(xué)過程由三個階段控制：（1）引發(fā)、（2）鏈傳播、（3）（4）終止。k_i，k_p，k_tc和k_td分別是四種反應(yīng)中的速率常數(shù)。每個Cur-Na與三個自由基（R^·）反應(yīng)，引發(fā)聚合物鏈生長，形成單體（M）。激活后的單體可以與其他單體反應(yīng)，聚合物鏈通過傳播而增長，形成Mn^·和Mm^·。當鏈傳播通過終止反應(yīng)終止時，形成聚合物（Mn和Mm）。c. Cur-Na和PEGDA聚合過程中官能團的轉(zhuǎn)化率與時間的關(guān)系。散射區(qū)域的自由基可以被Cur-Na快速消耗；水凝膠單體由于缺乏自由基而難以在散射區(qū)域形成聚合物。

圖4. 水平方向打印精度分析。a. 輻條狀圖案用于評估打印精度，從中心到外圍相鄰輻條之間的間隙增加。打印精度被定義為模糊區(qū)域直徑（紅色虛線圓圈）與輻條狀圖案直徑的比值。b. 載細胞結(jié)構(gòu)的熒光染色圖。c. 打印結(jié)構(gòu)的顯微圖像，顯示了純PEG-GelMA生物墨水（上）和添加了檸檬黃（中）和Cur-Na的生物墨水（下）的模糊區(qū)域（紅色虛線圓圈）大小與相對曝光能量的關(guān)系。E_r指相對能量，定義為實際光能與單位曝光量的比。d. 模糊區(qū)域大小與曝光能量的定量關(guān)系。e. Cur-Na的高精度打印窗口，灰色、紅色、藍色區(qū)域分別代表含1mM、2mM、3mM Cur-Na生物墨水的打印窗口寬度。f. 載細胞打印結(jié)構(gòu)的模糊區(qū)域大小與曝光能量之間的定量關(guān)系。

圖5. 多層打印中的中空通道打印性分析與評定高保真度的打印誤差分析。a. 具有不同直徑（D=300、500和700μm）通道的圓柱體的3D CAD設(shè)計。H表示圓柱體的高度，而h1、h2和h3是通道的中空部分。打印精度定義為中空部分與通道總長度之間的比率。b. 連續(xù)層打印中的散射效應(yīng)及其引起的過固化現(xiàn)象。c-e. 打印精度隨圓柱體直徑的高度和通道直徑的關(guān)系。f. 具有不同直徑的多通道結(jié)構(gòu)CAD設(shè)計。g. 分別使用含Cur-Na和檸檬黃的生物墨水打印的樣品。h. 通道的實際直徑與設(shè)計直徑間的差異。

圖6. Cur-Na在打印生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中常用的復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)時的分辨率和高保真度。a. 脊髓支架。它的結(jié)構(gòu)特點呈現(xiàn)不規(guī)則的通道和薄壁網(wǎng)絡(luò)，模仿脊髓的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。使用兩種類型的水凝膠成功地制備了支架：PEG-GelMA（10%）和甲基丙烯酸縮水甘油酯改性的絲素蛋白（Sil-MA（15%））。b. 具有多個分支、可灌注通道（200-800μm）和薄壁（~100μm）的血管網(wǎng)絡(luò)。通過注射有色染料溶液進行灌注。c. 具有獨。特拓撲特征（曲面、高孔隙率和連通性）的gyroid支架。d. 打印載HepG2細胞的gyroid支架并培養(yǎng)14天，展現(xiàn)了良好的細胞增殖效果。

圖7. 基于PC-12細胞體外培養(yǎng)的Cur-Na 細胞相容性評價。a. 細胞活死染色熒光圖展示了細胞14天的活力（綠色：活細胞；紅色：死細胞）。b. CCK-8測定細胞增殖情況。細胞在支架中增殖14天，PEG-GelMA/Cur-Na水凝膠中的細胞展現(xiàn)出最。。好的增殖效果。c. 使用PEG-GelMA/Cur-Na水凝膠制造的通道支架（直徑200μm）的熒光圖像顯示了均勻的細胞分布。最后一張圖像顯示了細胞沿著通道的生長情況。d. 第1、7和14天脊髓支架中通道的共聚焦圖像。e. 熒光圖像顯示種植在PEG-GelMA/Cur-Na支架表面的PC-12細胞的分化和突起形成（第7天）。Tuj-1：Beta3-微管蛋白；DAPI：4’，6-二胺基-2苯基吲哚。

結(jié)論

該研究提出了一種光吸收和自由基反應(yīng)協(xié)同作用的光抑制新機制，有效抑制光輔助3D打印中的光散射效應(yīng)。基于此機制，開發(fā)了一種新的光抑制劑（Cur-Na），具有以下獨。特優(yōu)勢：（1）顯著提高打印分辨率和保真度：在限制水凝膠的溶脹下，打印精度可接近打印機理論極限（~1像素）；（2）具有良好打印參數(shù)適應(yīng)性，極大簡化了打印參數(shù)優(yōu)化過程；（3）在制造具有微尺度通道和薄壁等復(fù)雜支架結(jié)構(gòu)上展現(xiàn)出卓。越能力，對于支架內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的運輸和氧氣的滲透具有重要意義；（4）能成功制造對光散射效應(yīng)尤其敏感的載細胞Gyroid支架，且在歷經(jīng)14天的培養(yǎng)后，支架內(nèi)細胞展現(xiàn)出良好的增殖態(tài)勢。（5）此方法可應(yīng)用于其他由自由基鏈生長聚合控制的可光固化墨水中（例如Sil-MA等）。該研究提供的將多尺度特征直接賦予組織結(jié)構(gòu)的方法，對于更好地模擬天然組織微環(huán)境至關(guān)重要。研究中確立的策略提高了生物3D打印高保真復(fù)雜結(jié)構(gòu)的可打印性和可操作性，從而助力更*的組織工程和再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用的實現(xiàn)。